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Schritte-Nachweis antigen-spez. zellulärer Immunant. Gutmann


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Schritte-Nachweis antigen-spez. zellulärer Immunant. Gutmann

Post#1by Eline » 11. May 2008 11:58

Dissertation
Tierärztliche Hochschule Hannover

Erste Schritte zum Nachweis antigen-spezifischer zellulärer Immunantworten gegen das E7-Protein des bovinen Papillomvirus Typ 1 beim Pferd v. Sabine Gutmann

:arrow: http://deposit.ddb.de/cgi-bin/dokserv?i ... 194497.htm

Kurzfassung:

Das equine Sarkoid ist ein semimaligner Hauttumor bei Pferden, Eseln und Maultieren, der durch die Infektion mit bovinem Papillomvirus (BPV) Typ 1 oder 2 hervorgerufen wird. Zur Therapie dieser Tumore ist ein Impfstoff basierend auf
BPV 1-L1/E7-chimären Virus-ähnlichen Partikeln (CVLPs) entwickelt worden. Eine therapeutische Vakzine muß in der Lage sein, tumorantigen-spezifische T-Zellen zu induzieren. Um überprüfen zu können, ob die CVLPs eine zytotoxische T-Zell-Reaktion bei immunisierten Pferden auslösen können, sollte in der vorliegenden Arbeit auf die Entwicklung eines Verfahrens hingearbeitet werden, mit dem antigen-spezifische zytotoxische T-Zell-Reaktionen bei Pferden gemessen werden können. Der zu entwickelnde Test basiert auf der durch Antigen induzierten IFN-g Produktion von CD8 positiven zytotoxischen T-Lymphozyten (CTLs). Dieses sollte mittels IFN-g-ELISPOT-Verfahren und / oder intrazellulärem IFN-g-Nachweis möglich sein. Deshalb wurden zunächst verschiedene monoklonale Antikörper (mAK) gegen das equine IFN-g (eqIFN-g) Protein hergestellt. Für die Entwicklung des ELISPOT-Verfahrens wurde mindestens ein Antikörperpaar benötigt, das unterschiedliche Epitope des eqIFN-g Proteins erkennt. Zu diesem Zweck wurden im ersten Schritt von drei voneinander unabhängigen Rattenhybridomklonen Antikörper gegen
eqIFN-g produziert. Damit wurde ein Sandwich-ELISA-System etabliert. Dabei zeigte sich, dass vermutlich die 3 monoklonalen Rattenantikörper dasselbe Epitop auf dem
IFN-g-Protein erkennen. Dies führte zur Entwicklung von Maus anti-eqIFN-g mAK, die unterschiedliche Epitope auf eqIFN-g binden. Mit einem Antikörperpaar der Maus anti-eqIFN-g mAKs wurde ein Sandwich-ELISA zur spezifischen Quantifizierung von eqIFN-g mit einer unteren Nachweisgrenze von 2ng/µl entwickelt.

Im Neutralisationstest unter Verwendung des Vesikulostomatitis Virus (VSV) auf der der Pferdezelllinie (E.derm) und den bovinen Zellen (MDBK) konnte nicht nur die IFN-g neutralisierende Kapazität der mAk geprüft werden. Es zeigte sich auch, dass im Gegensatz zu IFN-a das eqIFN-g über eine hohe Speziesspezifität verfügt und in seiner antiviralen Wirkung von seiner Glykosylierung abhängig ist.

Die Etablierung eines IFN-g ELISPOT-Verfahrens gelang mit den zur Verfügung stehenden Antikörpern leider nicht. Dafür waren sie aber geeignet intrazellulär equines IFN-g bei CD8-positiven wie bei CD8-negativen equinen T-Lymphozyten nach ausreichender Mitogenstimulation mit Hilfe von indirekter Immunfluoreszenz und Durchflusszytometrie nachzuweisen. Dies gelang sowohl bei frisch isolierten wie bei kryokonservierten equinen Lymphozyten. Auch wenn orientierende Versuche an 3 Pferden zum Nachweis von CD8 T-Zellen mit Spezifität für BPV 1-L1/E7 nicht erfolgreich waren, so sind für derartige Prüfungen antigenspezifischer T-Zellreaktionen mit den hier entwickelten und charakterisierten mAk samt der Darstellung möglicher Verfahren erste weiterführende Schritte getan.

Dissertation 177 Seiten von Sabine Gutmann
Aus der Arbeitsgruppe für Immunologie der Tierärztlichen Hochschule Hannover
Erste Schritte zum Nachweis antigen-spezifischer zellulärer Immunantworten gegen das E7-Protein des bovinen Papillomvirus Typ 1 beim Pferd

:arrow: http://elib.tiho-hannover.de/dissertati ... s_ws05.pdf
.....nur eine langweilige Frau hat einen perfekten Haushalt .....
Gruß Irene/ Eline
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